清腦宣竅方中藥有效成分和作用機理研究論文

1、器材

Waters 2695高效液相色譜儀，2696PDA檢測器，自動進樣；1100LC-MSD-Trap-XCT/Plus型液質聯用儀 （美國Agilent公司）；Sartorious BT 25S型1/100000電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；KQ-500DE型超聲波清洗器（崑山超聲儀器有限公司）；QL-901漩渦混和機（其林貝爾儀器製造公司）；臺式高速離心機（軍事醫學科學院實驗儀器廠），勻漿機。

梔子苷，人蔘皁苷Rg1，人蔘皁苷Rb1及三七皁苷R1對照品均購自中國藥品生物製品檢定所（批號分別為：110749-200309，110703-200322，110745-200312，110704-200318）；人蔘皁苷Re，Galioside，6α－Hydroxygeniposide，3,3',5,5'-四甲氧基-4,4'-二-β-D-葡萄糖雙環氧木脂素，6″－對香豆醯龍膽京尼平雙糖苷，藏紅花酸-1-葡萄糖（6-1）葡萄糖苷，京尼平龍膽雙糖苷，2α，3β，19α，23-四羥基齊墩果-12-烯-28-酸，人蔘皁苷Rb2，Rb3，Rh1、Rf，Rc，Rg2，Rg3，Rd及三七皁苷fa，R4，R7及 F2對照品由北京中醫藥大學石任兵教授課題組提供。

乙腈（Fisher公司），色譜純；屈臣氏重蒸水（液相用水）；Milli-Q系統純化水（液質用水）；肝素、水合氯醛及甲酸為分析純，均購自北京北化精細化學品有限責任公司。Cleanert C18 SPE固相萃取柱（3 ml，200 mg，60 μm，北京艾傑爾科技有限公司）實驗物件：SD大鼠：體重（300±10）g，雄鼠［北京市維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證編號：SCXK（京）2007－0001］。

2、方法

2.1 給藥劑量及腦組織處理方法單劑量灌服清腦宣竅有效部位（6.0 g/kg）；灌服清腦宣竅有效部位後1 h取出大腦，吸乾水分，精密稱重，加入腦重量兩倍體積的生理鹽水。以18 000 r/min勻漿，勻漿液加入兩倍體積的分析甲醇，渦旋振盪10 min,混合液在6 000 r/min下離心20 min,取出上清液。殘渣再加入兩倍體積甲醇渦旋振盪10 min, 6 000 r/min下離心20 min,兩次上清液混合，常溫減壓回收至幹。殘渣用5 ml液相水溶解，超聲振盪，上SPE固相萃取柱，先用水洗脫3 ml，再用甲醇洗脫2 ml，收集甲醇洗脫液，常溫減壓乾燥，殘渣加甲醇300 μl 漩渦溶解，即得供試品溶液。

2.2 HPLC-MS條件色譜柱：

Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；保護柱：Eclipse XDB-C18；柱溫：30℃；流速：1.0 ml /min；檢測波長：203，238nm；乙腈（A）-酸水（B）二元梯度洗脫，梯度為：5%A17 min →16%A23 min →16%A28 min →20%A34 min →22%A50 min →30%A65 min →45%A80 min →100%A。1100LC-MSD-Trap-XCT/Plus型液質聯用儀：質譜（MS）條件：ESI離子源；離子源溫度350℃；毛細管電壓：3 000 eV；負離子檢出模式；霧化氣壓力：60 psi；乾燥氣：N2；流速：12 L/min；掃描範圍：200～1 800 m/z。

傳統中藥研究與現代分析技術手段結合，是中藥現代化的`必須［7］。一個療效確切的複方進入人體內的成分譜中多數成分是否存在對疾病的多靶點基因表達的調控作用，必須建立在確認該成分（代謝產物）在靶器官內是否存在的基礎上，再進行體內外藥效學研究。